انواع PCR | واریانت های PCR استاندارد

انواع PCR

واریانت های PCR استاندارد

PCR-رونویسی معکوس (RT-PCR)

PCR در زمان واقعی یا PCR کمی (qPCR)

ترکیب RT-PCR/qPCR

واریانت های PCR استاندارد

تغییر در تکینک پایه ای PCR منجر به پیشرفت واریانت های PCR شد که در زیر توصیف شده اند:

PCR ویژه آلل

PCR ویژه آلل (Allele specific PCR)

PCR ویژه آلل امکان شناسایی مستقیم جهش نقطه ای در DNA را می دهد. این تکنیک به دانش قبلی درباره توالی DNA هدف مثل اختلاف بین آلل ها نیاز دارد و از پرایمری با انتهای '3 ناجور در برگیرنده تغییرات تک نوکلئوتیدی بهره می برد. دو پرایمر ویژه آلل، یکی برای هر آلل SNP  (پلی مورفیسم تک نوکلئوتیدی که به صورت snip تلفظ می شود) مورد نیاز است که یکی از دو پلی مورفسیم تک نوکلئوتیدی موجود در انتهای '3 را پوشش می دهد (شکل 2). ممکن است پرایمر معمول Reverse و Forward استفاده شوند. به طور کلی دو واکنش PCR برای شناسایی دو آلل یک SNP لازم است.

PCR نامتقارن

PCR نامتقارن (Asymmetric PCR)

این واریانت PCR ترجیحا برای تکثیر یکی از رشته های مولکول DNA هدف با استفاده از غلظت نابرابر پرایمر به کاربرده می شود به طوریکه چنین همانند سازی از روی علم ریاضیات با استفاده از پرایمر مازاد رخ می دهد.

PCR کلونی (Colony PCR)

نوعی از PCR است که به طور روتین در مطالعات ژنوم باکتریایی استفاده می شود. درج پلاسمیدهای دارای تعداد نسخه بالا مثل pUC19، pUC18 یا pBluescript در باکتری ها به طور معمول برای هدف های مختلف انجام می شود و PCR کلونی سریعا درج این پلاسمیدها را غربالگری مب کند. این روش دارای چند مزیت بر روش های سنتی غربالگری آبی،سفید است زیرا میتواند هردوی اندازه و جهت درج ناقل را تعیین کند. در حقیقت کلونی های سفید علاوه بر غربالگری از طریق روش آبی سفید سنتی، توسط روش PCR کلونی هم غربالگری می شوند تا از توالی یابی کلون های مثبت کاذب پرهیز شود. علاوه براین PCR کلونی به تولید مقدار کافی محصول مطلوب PCR به منظور توالی یابی کمک می کند.

PCR دژنره (Degenerate PCR)

واریانتی از PCR است که پرایمرهای دژنره را جهت تکثیر توالی ناشناخته پیوسته به توالی DNA شناخته شده، به کار می گیرد. پرایمرهای دژنره بر پایه همولوژی ژن شناخته شده و توالی یابی شده طراحی می شوند. این تکنیک شناسایی اعضای جدیدی از خانواده ژنی یا ژن های اورتولوگ از ارگانیسم مختلف را امکان پذیر می سازد.

PCR هات استارت (Hotstart PCR)

این تکنیک شامل مراحل PCR سنتی است به جز این که پلیمراز Taqزمانی به مخلوط واکنش اضافه می شود که بقیه اجزای PCR تا دمای ذوب DNA حرارت داده شده اند بنابراین از تکثیر غیر اختصاصی در دماهای پایین جلوگیری می کند. یا به طور جایگزین می توان از مهارکننده هایی با اتصال کوالان به پلیمراز استفاده کرد که فقط پس از رسیدن مخلوط واکنش به Tm از آن جدا می شوند.

 

PCR معکوس

PCR معکوس (Inverse PCR)

در حالی که PCR مرسوم به جفت پرایمر مکمل برای هر دو انتهای ' 3 DNA هدف نیاز دارد، PCR معکوس امکان تکثیر DNA را فقط با یک توالی شناخته شده می دهد. این تکنیک نیازمند یک برش و اتصال محدود کننده در توالی است که منجر به تشکیل قطعه DNA حلقوی می شود که می توان از توالی شناخته شده آن به عنوان جایگاه اتصال پرایمر جهت انجام PCR استفاده کرد.

PCR مینی پرایمر (Miniprimer PCR)

روش PCR استاندارد به پلیمراز Taq نیاز دارد که کارایی آن در سنتز DNA به علت نیاز به پرایمرهای طویلشان (20-30 نوکلئوتید) از دیگر آنزیم های همانند ساز کمتر است؛ بنابراین روش مینی پرایمر توسعه یافت. در این PCR پلیمراز Taq مهندسی شده و مینی پرایمر با طول 10 نوکلئوتید استفاده شده است. PCR مینی پرایمر در درک بیولوژی میکروبی جهت شناسایی توالی DNA محافظت شده طی تکامل مثل 16S rRNA پروکاریوتی یا 18S rRNA یوکاریوتی سودمند است که با PCR استاندارد غیر ممکن است. Xu و همکاران نقش PCR مینی پرایمر را با استفاده از تیتانیوم پلیمراز Taq و پرایمرهای کوتاه برای ژنوتایپینگ (تعیین ژنوتیپ) زیرگونه پانتوآ استوارتی ای ارزیابی کردند، که عامل سببی فساد باکتریایی استوارت در ذرت است.

PCR چندگانه

PCR چندگانه (Multiplex PCR)

PCR چندگانه، تغییر PCR به منظور شناسایی سریع حذف ها یا مضاعف شدگی ها در یک ژن بزرگ است، در 1988 ، حذف در ژن دیستروفین نخست با روش PCR چندگانه شناسایی شد. PCR چندگانه از مجموعه پرایمر چندگانه در داخل یک مخلوط منفرد PCR جهت تولید آمپلیکون با اندازه های مختلف و اختصاصی توالی های مختلف DNA، استفاده می کند.

این واریانت PCR چندین ژن را در یک آزمون منفرد مورد هدف قرار می دهد که به عبارت دیگر جهت انجام آن چندین برابر معرف و زمان بیشتر مورد نیاز خواهد بود (شکل 5). طول جفت باز آمپلیکون ها باید تفاوت کافی را جهت جدا سازی بهتر و تشکیل باند مجزا داشته باشند تا به راحتی در ژل مشاهده شوند. PCR چندگانه در بسیاری از زمینه های آزمون DNA مثل آنالیز حذف ها، جهش ها و پلی مورفیسم ها، میکروساتلایت ها (ریز ماهواره ها) و SNPها به طور موفقیت آمیزی استفاده شده است.

PCR آشیانه

PCR آشیانه (Nested PCR)

تغییر PCR جهت به حداقل رساندن تکثیر غیر اختصاصی و محصولات کاذب PCR طراحی می شود که امکان داشت سبب اتصال پرایمر به جایگاه های پیش بینی شده و ناخواسته مشابه DNA هدف شود. PCR آشیانه شامل 2 مجموعه ای از  پرایمر است که آن ها در دو اجرای (ران) پی درپی واکنش PCR استفاده می شوند(شکل 6). عملکرد مجموعه دوم پرایمر این است که به جایگاه هدف دوم در داخل توالی تکثیر شده با مجموعه اول پرایمر اتصال یابند. به طوری که بسیار بعید است که توالی کاذب یا ناخواسته، جایگاه اتصال برای هر دو مجموعه پرایمرها داشته باشد.

تکنیک PCR | تکنیک PCR چیست | آموزش تکنیک PCR

ادامه مطلب

PCR مستعد خطا | Error prone PCR

ادامه مطلب

PCR رونویسی معکوس

PCR رونویسی معکوس | RT- PCR

ادامه مطلب

پاسخ دهید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *