تکنیک های بلاتینگ

 

وقتی DNA دناتوره بشود ، تک رشته هایی DNA می توانند با سایر مولکول های DNA یا RNA تک رشت های با جفت شدن بازهای مکمل، مولکول هیبرید دو رشته ای تشکیل دهند. این جفت شدگی را هیبریداسیون نوکلیک اسید و یا به اختصار هیبریداسیون نامیده می شود که کاربرد گسترده ای در تشخیص، تعیین ویژگی و شناسایی قطعات DNA دارد.

قطعات نوکلیک اسید تک رشته ای که قبلا هویت آن ها شناخته شده است که پروب نوکلیک اسید یا پروب می نامند در هیبریداسیون استفاده می شود. پروب ها می توانند رادیواکتیو باشند یا با مواد شیمیایی رنگی و یا موادی که منجر به تولید فلورسنت می شوند برچسب دار می شوند.

 

تفاوت تکنیک های بلاتینگ :

🔵نمونه استفاده شده در:
وسترن⬅️ پروتیین
ساترن⬅️ DNA
نورتن ⬅️ RNA
می باشد.

🔵نوع پروب در
وسترن ⬅️ آنتی بادی
نورتن ⬅️ cDNA
ساترن ⬅️ cDNA

تفاوت تکنیک های بلاتینگ
تفاوت تکنیک های بلاتینگ

 

در لکه گذاری ساترن ، قطعات DNA در ژل به منظور هیبریداسیون باید دناتوره بشوند تا تک رشته ای بشوند، تا زمانی که به غشای سنتتیک انتقال می یابند بتواند با پروب هیبریداسیون تشکیل دهند. DNA تک رشته ای در غشا در معرض پروب برچسب دار قرار میگیرد. اگر این پروب مکمل هر یک از قطعات DNA تک رشته ای باشد ، هیبرید تشکیل می دهد و پروب در محل های قطعات مکمل به غشا متصل می شود. هیبریداسیون رخ داده با ردیابی برچسب متصل با غشا غشا قابل شناسایی است.

 

وسترن بلاتینگ

یکی از روشهای بلاتینگ است که برای تشخیص و آنالیز پروتئین‌ها استفاده می‌شود. این روش یک آزمایش تأییدکننده است و وجود نوعی پادتن(ایمونوگلوبولین نوع جی) علیه چند نوع پروتئین ویروسی را بررسی می‌کند . این روش در مقایسه با تست الیزا اختصاصی‌تر است ولی از حساسیت کمتری برخوردار است و چون آزمایشی نسبتاً گران محسوب می‌شود، به عنوان اولین آزمایش انجام نمی‌گیرد و بیشتر در تأیید نتایج مثبت شده تست الیزا بکار می‌رود. تست وسترن بلات در همراهی با تست الیزا٬ بیش از ۹۹٪ مورد اطمینان خواهد بود.

 

شکل چپ : مولکول های خالص شده ی DNAی چندین پلاسمید مختلف که با آنزیم های محدودگر تیمار شده و بعد از آن روی الکتروفورز ژل آگارز برده شده اند. شکل راست : لکه گذاری ساترن ژل DNAی نشان داده شده است در شکل سمت چپ است. بعد از لکه گذاری، DNAی موجود در ژل با پروب رادیواکتیوی هیبرید می شود. توجه شود که تنها برخی از قطعات DNA دارای توالی مکمل با پروب برچسب دار هستند. ردیف 6 دارای DNAیی است که به عنوان نشانگر اندازه استفاده شده و هیچ یک از باندهای آن با پروب هیبرید نمی شوند.
شکل چپ : مولکول های خالص شده ی DNAی چندین پلاسمید مختلف که با آنزیم های محدودگر تیمار شده و بعد از آن روی الکتروفورز ژل آگارز برده شده اند. شکل راست : لکه گذاری ساترن ژل DNAی نشان داده شده است در شکل سمت چپ است. بعد از لکه گذاری، DNAی موجود در ژل با پروب رادیواکتیوی هیبرید می شود. توجه شود که تنها برخی از قطعات DNA دارای توالی مکمل با پروب برچسب دار هستند. ردیف 6 دارای DNAیی است که به عنوان نشانگر اندازه استفاده شده و هیچ یک از باندهای آن با پروب هیبرید نمی شوند.

 

لکه گذاری نورترن

نیز مشابه ساترن می باشد با این تفاوت که مولکول RNA بجای DNA روی ژل تفکیک شده و به غشای سنتتیک برای اتصال پروب به آن منتقل می شود. لکه گذاری نورترن اغلب برای شناسایی mRNA استفاده می شود. شدت لکه گذاری نورترن برآورد کلی می دهد که چقدر mRNA از ژن هدف موجود بوده و بنابراین می توان برای ردیابی رونویسی از آن استفاده کرد. هیبریداسیونی که در این روش ها صورت می گیرد اغلب برای شناسایی ژن ها بعد از کلون سازی استفاده می شود. این روش بویژه زمانی مفید است که ژن کلون شده در میزبان بیان نمی شود یا روشی برای شناسایی محصول ژن در دسترس نیست.

 

یافتن کلون صحیح:
یافتن کلون صحیح:

 

در هیبریداسیون کلنی از پروب نوکلیک اسیدی برای شناسایی DNAی نوترکیب در کلنی ها استفاده می شود. در این روش از replica plating برای تولید یک نسخه از پلیت اصلی بر روی فیلتر غشایی استفاده می شود. سلول های روی فیلتر برای آزاد شدن DNA آن ها لیز می شوند، سپس این فیلتر برای ایجاد DNA تک رشته ای و تثبیت آن تیمار می شود. در مرحله بعد این فیلتر با پروب نوکلیک اسیدی برچسب دار تیمار می شود و اجازه هیبریداسیون به آن داده می شود، سپس برای جدا شدن پروب های غیر اختصاصی شستشو داده می شود.

اگر از پروب رادیواکتیو استفاده شده باشد، فیلتر را توسط فیلم اشعه X می پوشانند. بعد از ظهور فیلم، فیلم اشعه Xاز نظر وجود لکه ها بررسی می شود.

 

نویسنده : سعید کارگر

افزودن یک دیدگاه

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *