رفع اشکال تکنیک الکتروفورز عمودی | رفع اشکال تکنیک SDS PAGE

رفع اشکال تکنیک الکتروفورز عمودی | رفع اشکال تکنیک SDS PAGE

در ذیل لیستی از مشکلات احتمالی تکنیک الکتروفورز پروتئین آمده است که توضیحات آن نیز در کنار هر کدام ذکر شده است.

  • مشکل :‌ عدم پلیمریزاسیون یا پلیمریزاسیون ناقص ژل

علت: پایین بودن دمای محلول ها

رفع مشکل:‌قبل از استفاده لازم است دمای محلول ها به دمای محیط برسد (20-30 درجه سانتیگراد)

 

علت: کهنگی یا کم بودن مقدار کاتالیزورها مخصوصا پرسولفات آمونیوم

رفع مشکل: محلول تازه پرسولفات آمونیوم تهیه گردد. مقداری بیشتری پرسولفات آمونیوم به محلول ژل اضافه گردد.

 

علت:‌ کهنه بودن محلول استوک اکریل آمید

رفع مشکل:‌ محلول تازه اکریل آمید تهیه شود.

 

علت:‌ اثر اکسیژن هوا به خصوص در محلول های سرد

رفع مشکل:‌ دمای محلول ها به دمای محیط برسد. محلول ژل هواگیری شود.

 

علت:‌ غلظت بالای ماده احیا کننده 2-مرکاپتواتانول در ژل

رفع مشکل:‌ در صورت امکان 2-ME را در غلظت کم به ژل اضافه کنید یا آن را در محلول ژل وارد نسازید.

  • مشکل :‌ وجود باند قوی در ابتدای ژل جدا کننده

علت:‌ وجود تجمعات بزرگ و نامحلول پروتئین یا لیپوپروتئین در نمونه (مخصوصا در PAGE)

رفع مشکل:‌ نمونه را قبل از الکتروفورز 15 دقیقه در 20/000xg سانتریفیوژ نمایید. الکتروفورز را در حضور مواد تسهیل کننده حلالیت پروتئین ها انجام دهید.

 

علت: وجود ژل متراکم کننده (معمولا در page)

رفع مشکل:‌ در سیستم بافری پیوسته الکتروفورز را انجام دهید.

 

علت: بالا بودن درصد ژل نسبت به وزن مولکولی عده ای از پروتئین های موجود در نمونه

رفع مشکل:‌ در صورت امکان درصد ژل را پایین آورید، یا الکتروفورز را در ژل با شیب غلظت انجام دهید.

 

علت:‌ کاهش غلظت SDS یا ماده احیا کننده در SDS-PAGE

رفع مشکل:‌ غلظت SDS یا ماده احیا کننده  در بافر نمونه را افزایش دهید یا در صورت امکان نمونه پروتئین را رقیق کنید تا نسبت غلظت آن با SDS و ماده احیا کننده متناسب گردد.

 

علت: پایین بودن PH نمونه (بخصوص بعد از رسوب با تری کلرو استیک اسید)

رفع مشکل:‌ PH نمونه را تنظیم کرده یا در مقابل بافر مناسب دیالیز کنید. قبل از الکتروفورز، نمونه را در 20/000xg سانتریفیوژ نمایید.

  • مشکل :‌ منعقد نشدن بخشی از ژل اکریل آمید در قالب شیشه ای

علت:‌ مخلوط نشدن پرسولفات آمونیوم در محلول ژل مخصوصا در ژل های غلیظ

رفع مشکل:‌ بعد از افزودن پر سولفات آمونیوم به محلول ژل، آن را کاملا مخلوط کنید.

  • مشکل: جدا شدن ژل از شیشه یا طلق های قابل اتصال به ژل

علت:‌ کثیف بودن سطح شیشه

رفع مشکل:‌ سطح شیشه را کاملا تمیز نمایید.

 

علت: انعقاد ژل روی سطح آبگریز طلق یا کهنه بودن آن

رفع مشکل:‌ سطح آبدوست طلق به طرف ژل قرار گیرد. از طلق تازه استفاده شود.

  • مشکل :‌ چروکیده شدن ژل

علت:‌ گرمای زیاد حاصل از پلیمریزاسیون در ژل های با درصد بالا

رفع مشکل:‌ محلول ها خنک گردد. سرعت پلیمریزاسیون با تغییر مقدار پرسولفات آمونیوم کنترل شود.

 

علت:‌ گرمای زیاد در هنگام الکتروفورز به دلیل مقاومت الکتریکی.

رفع مشکل: الکتروفورز در جریان الکتریکی کمتر و در مدت طولانی تری صورت گیرد.

 

علت:‌ بالا بودن ضخامت ژل یا درصد ژل در هنگام خشک کردن یا قطع جریان برق در هنگام خشک شدن ژل در دستگاه خشک کن

رفع مشکل:‌ قبل از خشک کردن، ژل را نیم ساعت در محلول حاوی متانول 20-30  درصد و گلیسرول 3 درصد قرار دهید.

  • مشکل :‌ چاهک های نامنظم و ناقص در ژل بالا (Stacking gel)

علت: احتباس هوا در انتها یا کناره دندانه های شانه

رفع مشکل: شانه را خارج ساخته ، مجددا در محل خود قرار دهید، به نحوی که حباب هوا نداشته باشد.

 

علت: خارج ساختن شانه قبل از کامل شدن انعقاد ژل بالا

رفع مشکل:‌ پس از اطمینان از انعقاد ژل بالا، شانه را خارج نمایید، چاهک ها را با بافر الکترود بشویید.

  • مشکل:‌حرکت بیشتر رنگ نشانگر در بخش میانی ژل

علت:‌ بالا بودن دمای بخش میانی به دلیل تبادل حرارتی کمتر با محیط

رفع مشکل:‌ برای تبادل حرارتی یکسان از سیستم سیرکولاتور استفاده شود. در غیر این صورت در ولتاژ یا توان پایین کار کنبد

  • مشکل:‌ قرار نگرفتن نمونه در ته چاهک ها

علت: عدم وجود گلیسرول یا ساکارز در بافر نمونه

رفع مشکل: به بافر  نمونه گلیسرول یا ساکارز اضافه شود.

  • مشکل: جاری شدن نمونه در چاهک های کناری

علت:‌ بزرگتر بودن ضخامت اسپیسر ها نسبت به ضخامت شانه

رفع مشکل:‌ در هنگام تهیه ژل از شانه مناسب استفاده شود.

 

علت:‌ سرریز شدن چاهک ها از نمونه

رفع مشکل:‌ حدود 30-50 درصد هر چاهک از نمونه پروتئینی بریزید.

  • مشکل: خطوط رنگی در مسیر الکتروفورز در ستون ها

علت: حل شدن تدریجی توده های مولکولی موجود در نمونه

رفع مشکل: نمونه را قبل از الکتروفورز به مدت 15 دقیقه در حداقل 20/000xg سانتریفیوژ نمایید

  • مشکل: رانش کاتدی پروتئین ها در ایزوالکتروفوکوسینگ

علت: حل شدن گاز کربنیک در بخش قلیایی ژل

رفع مشکل:‌ محلول کاتولیت را هواگیری نموده، از NaOH با درجه خلوص بالا (دارای حداقل ناخالصی کربنات) برای تهیه آن استفاده کنید. از تماس هوا با ژل تا حد امکان خودداری شود. زمان الکتروفورز تا حد امکان کوتاه شود.

 

علت: الکترواسمز

رفع مشکل: استفاده از اکریل آمید با خلوص بالا در تهیه ژل جذب ترکیبات یونی آزاد با رزین های تعویض کننده یون (مثل آمبرلیت MB-6). افزودن گلیسرول به ژل در غلظت 10-15 درصد

  • مشکل: تبلور اوره در ژل

علت: پایین بودن درجه حرارت

رفع مشکل:‌ الکتروفورز در دمای 15 درجه سانتیگراد انجام شود.

  • مشکل:‌باندهای نامنظم و مواج

علت:‌ وجود حباب های هوا در ژل

رفع مشکل:‌ محلول ژل را هواگیری نمایید.

 

علت: ناهمگونی اندازه منافذ ژل

رفع مشکل: محلول ژل را کاملا مخلوط نمایید. مقدار پرسولفات آمونیوم را تنظیم نمایید تا زمان انعقاد ژل متناسب گردد.

 

علت: لرزش قالب شیشه ای در هنگام انعقاد ژل

رفع مشکل:‌ قالب شیشه ای را فیکس نموده و آن را کنار دستگاه های لرزاننده قرار ندهید.

 

علت: ادامه پلیمریزاسیون ژل در چاهک ها پس از خارج ساختن شانه

رفع مشکل:‌ پس از انعقاد  کامل ژل بالا و خارج نمودن شانه، چاهک ها را با بافر الکترود شستشو دهید.

 

علت: بالا بودن غلظت نمک در نمونه

رفع مشکل: نمونه را با بافر نمونه (1X) رقیق کرده یا در مقابل بافر مناسب دیالیز نمایید.

 

علت: عدم تماس کامل ژل با نوارهای کاغذی و یا الکترودهای فلزی

رفع مشکل: لبه نوارهای کاغذی را بطور مساوی روی لبه طولی ژل قرار دهید، سپس الکترودهای فلزی را بطور دقیق روی نوارها قرار دهید.

  • مشکل:‌ وجود ستون های رنگی با باندهای نا مشخص یا کاملا تفکیک نشده

علت:‌ پروتئولیز شدید در هنگام استخراج یا آماده سازی نمونه

رفع مشکل:‌ استخراج نمونه در دمای پایین و در حضور مهار کننده های پروتئیازها صورت گیرد. بعد از افزودن بافر نمونه در SDS-PAGE نمونه را سریعا در آب جوش قرار دهید.

 

علت:‌ پایین بودن کیفیت SDS

رفع مشکل:‌ SDS با درجه خلوص بالا تهیه شود.

 

علت: وجود غلظت بالای موادی مثل کلرید گوانیدیوم در نمونه

رفع مشکل:‌ در صورت امکان نمونه را رقیق کنید یا کلرید گوانیدیوم را با ترکیبات سازگار در الکتروفورز (مثل اوره) تعویض کنید.

  • مشکل:‌وجود باندهای کاذب در تمام ستون ها

علت: وجود باندهای کاذب در تمام ستون ها یا در سراسر عرض ژل

رفع مشکل: اثر 2-ME پس از رنگ آمیزی ژل با نقره (به صورت دو باند منتشره در موقعیت های 50 و 67 کیلو دالتون)

رفع مشکل: به جای 2-ME از دی تیوتریتول استفاده نمایید یا ژل را با روش دیگری رنگ امیزی کنید.

 

علت: آلوده شدن بافر نمونه

رفع مشکل: بافر تازه تهیه نمایید.

 

علت: وجود ناخالصی در بافر مخزن بالا

رفع مشکل:‌ از مواد شیمیایی با خلوص و کیفیت بالا برای تهیه بافرها استفاده نمونه، ترجیحا از بافرها مجددا استفاده نکنید.

  • مشکل: عدم تکرار پذیری نتایج الکتروفورز

علت: پروتئولیز نمونه در هنگام استخراج یا نگهداری آن

رفع مشکل: استخراج نمونه در دمای پایین و در حضور مهارکننده های پروتئاز صورت گیرد. نمونه در شرایطی نگهداری شود که دچار حداقل تغییرات گردد.

 

علت: متناسب نبودن مقدار SDS و یا ماده احیا کننده در بافر نمونه نسبت به پروتئین (در SDS-PAGE)

رفع مشکل: غلظت SDS و یا ماده احیا کننده در بافر نمونه افزایش یابد یا در صورت امکان رقیق گردد.

 

علت:‌ تغییر در روش یا شرایط رنگ آمیزی

رفع مشکل: ژل ها را با یک روش ثابت و در شرایط یکسان رنگ آمیزی کنید.

 

 

افزودن یک دیدگاه

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *